非食用著色劑酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7，染料索引號：C.I. 15510，是一種常用的工業(yè)染料，有強(qiáng)致癌性。因其色澤鮮艷、勻染性好、價格低廉等特點，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生產(chǎn)加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用著色劑的檢測范圍。目前，guo家已經(jīng)發(fā)布3個推薦性的食品中酸性橙Ⅱ?qū)Ｓ脵z測標(biāo)準(zhǔn)，但由于不同實驗室間儀器、人員、實驗耗材、樣品等條件存在差異，完全執(zhí)行方法就能達(dá)到回收率、精密度要求的情況很少。因此，根據(jù)實際情況進(jìn)行方法的優(yōu)化是必要的。

更近，小編在用不同的基質(zhì)按照標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ號的檢測方法》做酸性橙Ⅱ回收實驗時，發(fā)現(xiàn)回收率不很理想，而且6.1.2所規(guī)定的固態(tài)樣品前處理方法非常耗時（特別是凈化前提取液需“濃縮約至10mL”這一步）。因此小編依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法對不同實驗環(huán)節(jié)進(jìn)行了一些優(yōu)化，在這里將全過程分享給各位朋友以供參考交流~

樣品凈化步驟優(yōu)化涉及SPE小柱與濾膜的選擇、固相萃取操作步驟。

首先，我們需要按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行實驗，驗證所用SPE小柱與濾膜是否滿足當(dāng)下實驗條件需求：

1. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)3.6節(jié)（見下圖）選擇對應(yīng)的SPE小柱。

在這里，小編移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液，加10mL水混勻作為上樣溶液,并根據(jù)6.1.3分別收集上樣液、淋洗液、洗脫液、二次洗脫液進(jìn)行上機(jī)檢測（此方法又稱“分步留樣”，是分析SPE操作過程中影響回收率的環(huán)節(jié)及原因的常用方法）。

3. 選擇合適的濾膜過濾樣液，上機(jī)檢測。

根據(jù)6.1.3，樣液上機(jī)前要過膜凈化。我們都知道，濾膜作用是凈化樣液，防止雜質(zhì)污染色譜柱。但使用濾膜（或使用不合適的濾膜）可能會影響目標(biāo)物的回收率甚至引入雜峰。因此，小編嘗試了三種過膜方式：1) 不過膜；2) 水系濾膜；3) Nylon濾膜。

藍(lán)色為樣液不過膜，峰面積12.0191

粉色為樣液過水系濾膜，峰面積11.4695

黑色為樣液過Nylon濾膜，峰面積6.4975

結(jié)果發(fā)現(xiàn)過膜后，過膜樣液的圖譜峰面積：過Nylon濾膜＜過水系濾膜＜不過膜，說明過水系膜或有機(jī)系膜都對目標(biāo)物造成一定損失。因此后續(xù)實驗的樣液均不過膜上機(jī)。建議本實驗樣液上機(jī)前不過膜。

更后，小編發(fā)現(xiàn)上樣液、淋洗液以及兩次的洗脫液中都沒有目標(biāo)物酸性橙Ⅱ檢出，酸性橙Ⅱ更終的回收率已經(jīng)達(dá)到了95%-105%，滿足了檢測的要求。

樣品提取步驟優(yōu)化

稱取樣品2g（±0.01g）于50mL離心管中，加入20mL乙醇-氨溶液，超聲提取30min，離心10min（4000r/min），吸取上清液于另一50mL離心管中；殘渣中加入20mL乙醇-氨溶液，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，混勻，準(zhǔn)確移取20mL上清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少于5mL,轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，用水定容至10mL，待凈化。

SPE柱：月旭Welchrom? NH2規(guī)格：500 mg/6mL

活化：依次用5mL甲醇，5mL2%甲酸水溶液過柱，棄去流出液

上樣：將待凈化液全部上樣，自然流干，棄去流出液

淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液，再用5mL甲醇淋洗小柱，棄去流出液

洗脫：用5mL10%氨水甲醇溶液，收集于15mL試管中，抽干小柱

濃縮：氮吹至近干，用水定容至1mL,上HPLC檢測。

色譜柱：月旭Ultimate?XB-C18,4.6×250mm,5μm

流動相：乙酸銨：甲醇=35:65

柱溫：35℃

進(jìn)樣量：20μL
檢測波長：484nm

流速：1.0mL/min

總結(jié)