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敲黑板?。。is標簽融合蛋白純化常見問題和解決方案全收納

2020-04-16

His標簽融合蛋白的純化是借助于層析介質(zhì)上的過渡金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等)與His融合蛋白上的His標簽的配位作用實現(xiàn)目標蛋白的分離。組氨酸(His)的殘基上帶有1個咪唑基團,可以和Ni2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬離子上,這些金屬離子通過螯合配體固定在層析介質(zhì)上,因此帶有His標簽的蛋白可以特異性的吸附在螯合了Ni2+等過渡金屬離子的層析介質(zhì)上,而其他不含His標簽的雜質(zhì)蛋白則不能吸附或僅微弱吸附在介質(zhì)上。通過提高緩沖液中的咪唑濃度進行競爭性洗脫,可以將His標簽融合蛋白從層析介質(zhì)上解吸附下來,從而得到較高純度的目標蛋白。

常用的His標簽融合蛋白純化的填料有Ni Tanrose 6FF(NTA/IDA)金屬螯合親和填料,但是在使用過程這種常常會出現(xiàn)一些問題,這里就給各位老師介紹下常見問題和解決方案

填料清洗

當填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時,需要進行在位清洗操作 (Cleaning-in-Place,CIP)。

建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強疏水結(jié)合的蛋白,脂蛋白和脂類

通過使用 30%異丙醇清洗 5-10 個柱體積,接觸時間為 15-20 分鐘可以去除此類污染物。然后,再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液, 清洗填料 2 倍柱體積。例如,含有 0.1–0.5% 非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液,接觸時間 為 1–2 小時。去污劑處理后,需要使用 70%的乙醇清洗 5 個柱體積,以徹底去除去污劑。更后使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。

去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用 1.5M NaCl 溶液接觸時間為 10-15 分鐘清洗。然后,再使用去離子水清洗 10 個柱體 積。

填料再生

組氨酸標簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使 用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺,或者填料載量明顯變低時,需要進行對填料進行鎳離子剝離和重新 掛鎳離子,也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi),按照下面操作流程進行鎳離子 剝離和重新掛鎳離子。

1. 使用 0.2 M 醋酸溶液(含 6 M GuHCl)清洗 2 倍柱體積;

2. 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;

3. 使用 2% SDS 清洗 3 倍柱體積;

4. 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;

5. 使用乙醇清洗 5 倍柱體積;

6. 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;

7. 使用 100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體積;

8. 使用去離子水清洗 5 倍柱體積;

9. 使用 100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體積;

10. 使用去離子水清洗 10 倍柱體積;填料再生后,可以立即使用,也可以保存在 20%的乙醇中,置于 4°C 保存。

常見問題及解決方案

01. 蛋白不掛柱

可能原因:His標簽是否丟失

解決方案:大腸桿菌表達外源蛋白過程中,常出現(xiàn)序列丟失的現(xiàn)象,若是標簽丟失,蛋白自然就無法掛柱了??刹捎肳estern-Blot方法通過His抗體檢測目標蛋白是否存在His標簽。

可能原因:His標簽是否暴露在融合蛋白表面

解決方案:在蛋白中加入適量的尿素或者鹽酸胍等變性劑,若此時蛋白可以掛柱,說明蛋白表達過程中His標簽可能暴露不充分,這個時候可以嘗試在緩沖液中加入變性劑進行純化。若因蛋白本身原因不能添加變性劑,則只能嘗試上游條件的修改,要么增加His標簽長度,提高標簽暴露的幾率,要么修改His標簽的位置。

可能原因:更換過渡金屬離子

解決方案:如果選擇用的是Ni2+或Co2+,換成Cu2+或Zn2+則就有可能掛柱了。

可能原因:緩沖液選擇是否正確

解決方案:如果緩沖液中需要添加巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)等還原劑,則需要選擇具有NTA配基的螯合介質(zhì)(常規(guī)條件下選擇IDA配基的螯合介質(zhì)即可)。

如果緩沖液中含有EDTA等具有強螯合作用的試劑,應在純化前去掉。

此外,適當提高緩沖液pH值、降低緩沖液中的鹽濃度或者更換成磷酸鹽緩沖液都可能提高His標簽蛋白的掛柱能力。

可能原因:提高接觸時間

解決方案:適當降低流速,提高蛋白與螯合介質(zhì)的接觸時間,可以提高目標蛋白的掛柱能力。

02. His標簽蛋白掛柱后洗脫不下來

可能原因:洗脫強度不夠

解決方案:可適當增加洗脫液中咪唑的濃度或者降低pH值。

可能原因:蛋白和層析介質(zhì)之間存在非特異性吸附

解決方案:可以嘗試在洗脫液中添加去垢劑(如0.2%的TritionX-100)。

可能原因:蛋白是否沉淀在層析介質(zhì)內(nèi)部

解決方案:可以嘗試降低上樣量或通過咪唑梯度洗脫的方式來避免蛋白沉淀。

可能原因:改變緩沖液條件

解決方案:降低緩沖液pH、提高咪唑濃度、提高鹽濃度或者換成Tris-HCl緩沖液都有可能解決目標蛋白洗脫不下來的問題。

可能原因:更換過渡金屬離子

解決方案:如果用的是Ni2+,可以嘗試換成Co2+,降低目標蛋白與過渡金屬離子的螯合作用。

03. 洗脫后的His標簽蛋白純度不夠

可能原因:優(yōu)化過渡金屬離子種類

解決方案:純度不夠的主要原因是宿主細胞蛋白中的一些含有組氨酸的雜蛋白吸附在鏊合介質(zhì)上。因此,可以采用螯合能力弱的Co2+作為過渡金屬離子,使得含有組氨酸的雜蛋白無法吸附在介質(zhì)上,從而提高目標蛋白的純度。

可能原因:優(yōu)化上樣和洗脫條件

解決方案:尋找更優(yōu)的上樣和洗脫條件,抑制雜蛋白的吸附(如增加上樣緩沖液中咪唑的濃度),將雜蛋白和目標蛋白盡可能的分開。

可能原因:雙標簽純化

解決方案:在進行上游構(gòu)建時,給目標蛋白加雙重標簽,通過兩步親和層析,提高目標蛋白的純度。

可能原因:多步純化

解決方案:在金屬螯合層析之后,根據(jù)蛋白分子量大小和帶電荷情況,加一步凝膠過濾層析或者離子交換層析,嘗試將目標蛋白與雜質(zhì)進一步分離開來,提高目標蛋白純度。

這些問題有沒有解決您的疑惑呢?如果您還有蛋白純化相關問題或?qū)ξ覀儺a(chǎn)品感興趣的話,歡迎撥打月旭科技400-810-6969垂詢,或者咨詢月旭科技當?shù)劁N售代表和經(jīng)銷商。