2020-09-01
很多時(shí)候,實(shí)驗(yàn)室的小伙伴們都是參照標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可標(biāo)準(zhǔn)上一句“以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑”就足夠讓小伙伴們選擇困難癥犯,更不用說是自己做方法開發(fā)的實(shí)驗(yàn)了。的確,色譜是一門實(shí)驗(yàn)學(xué)科,沒有誰能在未做實(shí)驗(yàn)的情況下預(yù)測(cè)出哪一根色譜柱能完成分離任務(wù),尤其是當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)沒有明確推薦色譜柱品牌型號(hào)的時(shí)候,這也就導(dǎo)致很多小伙伴經(jīng)常內(nèi)心OS:C18柱那么多,哪個(gè)才能分的更好?
別急,雖然我們不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,但把握基本的色譜柱性能參數(shù)還是可以做到的。下面就聽小編細(xì)細(xì)道來。
01. 載碳量
眾所周知,反相C18在當(dāng)今色譜分離領(lǐng)域依舊承擔(dān)著極大比例的分離任務(wù),就是因?yàn)槠湫再|(zhì)適合大多數(shù)化合物的色譜分離,那么在選擇色譜柱的時(shí)候,就一定要注意色譜柱本身的適用性,盡可能選擇普適性強(qiáng),適用面廣的色譜柱,而C18柱的“載碳量”這一參數(shù),就是尤為重要的參數(shù)之一。
對(duì)于一根普適性強(qiáng)的C18色譜柱,載碳量參數(shù)Z好是在10%~20%之間,尤以20%附近Z佳(16%-22%),因?yàn)檫@樣比例略高的載碳量,在保證了化合物能有效保留的前提下,活性位點(diǎn)數(shù)量減小,出現(xiàn)殘留吸附的情況也會(huì)減小。另外,稍高于普通C18的鍵合密度也有助于色譜鍵合相選擇性的提高。
02. 硅膠純度
除了特殊情況以外,越是適用性強(qiáng)的填料越要選擇B型硅膠。B型硅膠的硅膠純度>99.999%,金屬離子含量<10 ppm,并且孔徑和粒徑分布更加均勻,這樣得到的色譜峰展寬更小,峰形更加對(duì)稱。
03. 封尾
不同品牌色譜柱的封尾工藝和封尾試劑不一樣,這也是導(dǎo)致都是C18,性質(zhì)差異卻較大的原因之一。除非標(biāo)準(zhǔn)特殊說明使用未封尾色語柱,一般情況下,優(yōu)先選擇使用封尾的色柱(End Capped),尤其是雙封尾色造柱,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。關(guān)于色譜柱的封尾,有疑問的小伙件速去補(bǔ)課:“封尾”二字,臣妾真的已經(jīng)說倦了!
04. 比表面積
可能很多小伙伴都會(huì)有意無意地忽略掉色譜柱的比表面積這個(gè)參數(shù),其實(shí)這也是影響色譜柱性能的一個(gè)很重要的參數(shù)。比表面積的大小,將影響到鍵合相覆蓋率的高低,以及目標(biāo)物與鍵合相發(fā)成相互作用的概率大小。比表面積的大小,還會(huì)影響梯度平衡時(shí)間的長(zhǎng)短。那么,在選擇普適性強(qiáng)的色譜柱的時(shí)候,盡可能選擇比表面積在180m2/g~450m2/g的色譜柱,像常見的320m2/g,350m2/g,420m2/g,450m2/g,都是適用面比較廣的。
05. 孔徑
孔徑的選擇取決于分子量的大小。一般來說,要求孔徑是分子直徑三倍以上,這樣分子才能順利進(jìn)入孔中有所保留。以分子量2000為界,分子量<2000,可以選擇100?、120?、150?等孔徑;分子量>2000,如多肽,核酸等大分子的分離,可以選擇300?,甚至孔徑更大的色譜填料。
06. 色譜柱規(guī)格
如果標(biāo)準(zhǔn)上有指定具體的色譜柱規(guī)格,那無需多言。但當(dāng)我們自己在做方法開發(fā)的時(shí)候,無從得知什么規(guī)格更合適,而柱長(zhǎng)、內(nèi)徑、粒徑的不同又會(huì)影響到柱效、分離度、保留時(shí)間等系統(tǒng)適用性值,選擇的不合適還可能造成色譜柱壓力過高或污染。因此,保險(xiǎn)起見,小伙伴們一開始可以選擇4.6×250mm,5μm的色譜填料,這樣5μm粒徑柱壓不會(huì)很高,也便于沖洗維護(hù);柱長(zhǎng)夠長(zhǎng),多組分樣品也具有一定的分離效率;柱內(nèi)徑也不至于太小而造成超載。
07. 特殊基團(tuán)
特殊基團(tuán)一般是指為了使得色譜填料具有獨(dú)特的特性和不一樣的選擇性,從而在色譜柱的鍵合工藝或封尾工藝過程中,添加的特殊官能團(tuán)試劑。這些試劑的加入固然有助于分離一些本不易分離的組分,但是,在進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn),或方法建立初期,不建議選擇添加特殊基團(tuán)的色譜柱,否則色譜分離的重現(xiàn)性可能在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中成為潛在的問題。
怎么樣,通過上述的介紹,小伙伴是不是現(xiàn)在對(duì)色譜柱的參數(shù)有了更全面的認(rèn)識(shí)了呢,以后在選擇色譜柱的時(shí)候也會(huì)更有方向感,不會(huì)再如“霧里看花”一般不知如何選擇了吧。
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