分子排阻色譜，有時(shí)又叫“尺寸排阻色譜”或“體積排阻色譜”，是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。

分子排阻色譜法的分離原理為分子篩機(jī)制，色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經(jīng)過(guò)修飾的凝膠，如葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠等為填充劑，這些填充劑表面分布著不同孔徑尺寸的孔。分子進(jìn)入色譜柱后，它們中的不同組分按其分子大小進(jìn)入相應(yīng)的孔內(nèi)，大于所有孔徑的分子不能進(jìn)入填充劑顆粒內(nèi)部，在色譜過(guò)程中不被保留，更早被流動(dòng)相洗脫至柱外，表現(xiàn)為保留時(shí)間較短；小于所有孔徑的分子能自由進(jìn)入填充劑表面的所有孔徑，在色譜柱中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，表現(xiàn)為保留時(shí)間較長(zhǎng)；其余分子則按分子大小依次被洗脫，如下圖。

不同分子的物質(zhì)的分子排阻洗脫示意圖

雖說(shuō)分子排阻色譜的流動(dòng)相和反相色譜的流動(dòng)相很相似，但其分離機(jī)理卻是相差甚遠(yuǎn)。下表為大家列出了兩種分離模式的異同：

那么分子排阻色譜在使用過(guò)程中究竟有哪些特別之處，今天就來(lái)一探究竟吧。

01 固定相

葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠聚合物基質(zhì)的填充劑做固定相時(shí)，要千萬(wàn)注意流動(dòng)相和樣品中不可以出現(xiàn)任何有機(jī)溶劑，否則極易導(dǎo)致基質(zhì)破碎。如《中國(guó)藥典》中規(guī)定的頭孢類(lèi)聚合物的檢測(cè)方法：

《中國(guó)藥典》2020版頭孢類(lèi)化合物聚合物測(cè)定

親水硅膠多為表面鍵合親水薄膜的高純硅膠，具有良好穩(wěn)定性和批次重現(xiàn)性。如月旭科技Xtimate? SEC填充劑采用獨(dú)特的化學(xué)鍵合技術(shù)，在硅膠表面鍵合親水性聚合物以及親水性二醇基團(tuán)（如下圖）：

雙重鍵合機(jī)制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物樣品的非特異性吸附極小，因而可廣泛應(yīng)用于水溶性聚合物及生物大分子的分離和測(cè)定。

親水硅膠填料還有一個(gè)顯著特點(diǎn)，就是會(huì)有眾多孔徑選擇，以適合不同分子量大小的高分子化合物的分離。通常情況下，120?、200?和300?的孔徑可適合大多數(shù)多肽、蛋白等高聚物的分子量分離，更大分子量的高聚物則要選擇更大孔徑的填料。

02 流動(dòng)相

分子排阻色譜根據(jù)流動(dòng)相的水溶性，分為凝膠過(guò)濾（GFC），凝膠滲透（GPC）。親水硅膠填充劑做固定相時(shí)，流動(dòng)相多為上述水溶性溶劑，常稱(chēng)作凝膠過(guò)濾（GFC或SEC）。而凝膠滲透的流動(dòng)相多為脂溶性溶劑，如《中國(guó)藥典》22種有機(jī)氯的供試品前處理GPC步驟：

《中國(guó)藥典》2020版通則2341d一法22種有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥殘留量測(cè)定法

03 方法開(kāi)發(fā)

在使用月旭科技Xtimate SEC色譜柱進(jìn)行分子量分布的方法開(kāi)發(fā)中，有以下因素可能影響分離效果：

分子量

可根據(jù)目標(biāo)物的分子量，來(lái)選擇合適孔徑的色譜柱。

樣品與流動(dòng)相

為避免色譜柱堵塞，所有樣品和溶劑，包括緩沖鹽，都必須在使用前用0.45μm或0.22μm濾膜過(guò)濾。Xtimate SEC可以使用水或有機(jī)溶劑與水的混合物，與大多數(shù)緩沖鹽溶液也兼容。流動(dòng)相使用前需脫氣，否則可能出現(xiàn)柱壓和基線波動(dòng)較大。這時(shí)可用較大流速?zèng)_洗色譜柱2-5min，如對(duì)于7.8*300mm的色譜柱，可用1.25 mL/min的流速。

離子強(qiáng)度

色譜柱中不可避免會(huì)存在其他次級(jí)作用力，為了更大限度降低填料與被測(cè)物的次級(jí)作用力，必須調(diào)整流動(dòng)相的離子強(qiáng)度。NaCl是SEC分離中比較常用的鹽，可通過(guò)調(diào)整離子強(qiáng)度，減少次級(jí)作用力，進(jìn)而改善峰形和分離效果。

pH

流動(dòng)相的pH調(diào)整，更多也是為了減少色譜柱中的次級(jí)作用對(duì)被測(cè)物的影響，所以測(cè)定過(guò)程中需選擇合適的pH。為獲得z佳分離效果和延長(zhǎng)使用壽命，建議使用pH在 2-7.5 范圍內(nèi)的流動(dòng)相。

流速

盡量采用低流速測(cè)試，可以提高分離度，進(jìn)而獲得更好的測(cè)試效果。內(nèi)徑為 4.6mm 和 7.8mm 的色譜柱，一般建議其正常操作流速分別為 0.1-0.4 和 0.1-1.25 mL/min。

柱長(zhǎng)

通過(guò)增加色譜柱的長(zhǎng)度可以改善SEC分離度，所以在分離過(guò)程中，在一根色譜柱達(dá)不到分離效果時(shí)，可以考慮兩根色譜柱串聯(lián)，甚至不同孔徑的色譜柱串聯(lián)（注：一般大孔徑的在前，小孔徑的在后）。這種條件下通常也會(huì)造成出峰時(shí)間延后，及系統(tǒng)壓力增加。

柱溫

z高操作溫度為 80℃。為了獲得更長(zhǎng)的使用時(shí)間，z佳操作溫度為 10-30℃。長(zhǎng)時(shí)間在高溫（>80℃）下操作也會(huì)損壞色譜柱，這種情形在高的 pH（>7.5）條件下尤其突出。

更后，在使用月旭科技Xtimate SEC色譜柱過(guò)程中，注意盡管Xtimate SEC可在高至2000psi 的壓力下使用，但正常的操作壓力應(yīng)當(dāng)?shù)陀?500 psi。長(zhǎng)時(shí)間在高壓下運(yùn)行會(huì)損壞色譜柱和輸液泵。由于壓力來(lái)源于流速，因此更大流速將受制于系統(tǒng)所能承受的壓力。一般而言，柱壓會(huì)隨著色譜柱使用時(shí)間的增加而逐漸增加。Xtimate SEC色譜柱日常使用完后沖洗，建議保存在高比例的水-有機(jī)溶劑中。