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液相色譜分析流動相中酸的選擇

2023-01-10

磷酸、醋酸以及液相分析中常用到的酸（常見的還比如甲酸，三氟乙酸等），他們的主要區(qū)別和選擇在于：

各自的酸性不同

磷酸的酸性比醋酸強，就是說，磷酸可以把流動相的pH值調(diào)到更低。

紫外本底

有些酸有紫外本底，如甲酸，乙酸；有些沒有，如磷酸。這樣，在使用較低波長檢測的方法時，就要考慮使用紫外本底小的酸。冰醋酸在短波長檢測下應(yīng)該慎用。

揮發(fā)性

有些酸是揮發(fā)性酸，如甲酸，乙酸，三氟乙酸等；有些不揮發(fā)，如磷酸。使用不揮發(fā)酸，流動相的pH相對穩(wěn)定，而揮發(fā)性酸可能隨時間造成流動相pH緩慢改變。但是，不揮發(fā)酸的不揮發(fā)性，限制了它們在液質(zhì)聯(lián)用時候的使用。

離子強度

酸的離子強度不同，離子強度在很多情況下影響被分析物的解離和性質(zhì)，造成保留和峰型的改變，通常離子強度為： 三氟乙酸>磷酸＞甲酸>乙酸。離子強度很高的酸，通常會對液質(zhì)聯(lián)用產(chǎn)生強烈的抑制，如三氟乙酸，幾乎可以讓負(fù)模式掃描信號全部被抑制。

實例：甘草酸銨含量測定液相色譜分析，結(jié)構(gòu)式：

微信截圖_20230110102447.png

方案一

使用初始方法濃度36.5%醋酸進(jìn)行柱子篩選：

1）條件為：甲醇：醋酸：水=78：0.3：22，柱溫30，流速1mL/min，

Ultimate? LP-C18 (4.6*250mm，5μm)，效果圖：

微信截圖_20230110102432.png

分析：此條件下基本分離，但雜質(zhì)靠近主峰。

2）改變流動相比例為甲醇：醋酸：水=75：0.3：25，柱溫30，流速1mL/min，Ultimate? LP-C18（4.6*250mm，5μm)，效果圖：

微信截圖_20230110102539.png

分析:  主峰包含雜質(zhì)峰，分離度降低。

3）保持原流動相比例，改變柱溫為25度，效果圖：

微信截圖_20230110102621.png

分析：此條件下分離度>1.5，雜質(zhì)距離主峰較遠(yuǎn)。

4）使用同款色譜柱重現(xiàn)，效果圖：

微信截圖_20230110102628.png

分析：柱間分離情況及保留時間有差異。

方案二

1）使用濃度99.5%的冰醋酸，條件為：甲醇：冰醋酸：水=78：0.3：22，柱溫40，流速1mL/min，篩選更優(yōu)柱子月旭Topsil? C18（4.6*250mm, 5μm），效果圖：

微信截圖_20230110102637.png

分析：此條件下分離度仍不夠。

2）改變流動相比例為甲醇：冰醋酸：水=72：0.3：28，柱溫40，流速1mL/min，Topsil? C18（4.6*250mm，5μm），效果圖：

微信截圖_20230110102751.png

3）改變柱溫為30，流動相比例為甲醇：冰醋酸：水=72：0.3：28，流速1mL/min，Topsil? C18（4.6*250mm，5μm），效果圖：

分析：分離度>1.5，達(dá)到要求。

4）多針重現(xiàn)，效果圖：

微信截圖_20230110102929.png

分析：保留時間較小差異，分離度良好。

結(jié)論：使用36.5%醋酸的流動相體系時，在合格的色譜柱條件下，選擇4支重現(xiàn)，保留時間差異大?？蓮囊韵陆嵌确治觯?/span>

1）該物質(zhì)本身就是一個兩性離子，有弱酸和弱堿離子，在此條件下，流動相本身的緩沖作用很有限。

2）流動相的pH在4-5之間，這時候在反相C18中硅羥基的解離狀態(tài)是更活躍的時候（硅羥基的pKa在4.2至4.5之間），物質(zhì)對填料狀態(tài)以及柱子之間的差異很敏感，體現(xiàn)在用不同支的色譜柱差異大。在檢測甘草及其制品中的該物質(zhì)時，均出現(xiàn)過這樣的現(xiàn)象。

3）醋酸屬揮發(fā)性酸，在使用36.5%乙酸和99.5%冰乙酸時，等量的變化在兩種流動相體系中的影響程度不同，引起色譜結(jié)果差異性不同。