02 流動相優(yōu)化及測試結果圖譜

2.1 初步嘗試流動相：0.05mol/L庚烷磺酸鈉+0.05mol/L磷酸二氫鉀，PH=4.60。

結果：化合物3保留時間2.6min，化合物1不出峰。估計是化合物1保留太強未洗脫下來。接下來，調整pH并增加有機相的比例，來加大洗脫能力。

2.2 流動相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調pH=2.30）：甲醇=60：40。

混合對照圖譜如下：

實驗中將庚烷磺酸鈉改為辛烷磺酸鈉，增加有機相（甲醇）比例，結果三個物質分離良好，但是化合物1（19.9分鐘）峰型太差，下一步優(yōu)化化合物1的峰型。

2.3 流動相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調pH=2.30）：乙腈=80：20。

化合物1圖譜：

基于上一次實驗，將有機相甲醇變?yōu)橐译?，通過改變選擇性看是否峰型會有改善。結果發(fā)現(xiàn)并沒有任何改善，而且發(fā)現(xiàn)這個方法中有機相只提供洗脫能力，不提供選擇性改變作用。

2.4 流動相：緩沖液（緩沖液：1.00g十二烷基磺酸鈉，50mM氯化銨至500mL水，用磷酸調pH=1.80）：甲醇=60：40。

混合對照圖譜：

當時換成這個流動相的主要思路是，加十二烷基磺酸鈉使保留更強，加氯化銨提高離子濃度，調pH至1.80強酸性使化合物1中-NH₂官能團作用更弱，達到優(yōu)化峰型的目的，但是效果很差?；仡^總結發(fā)現(xiàn)我們所有的目光都聚焦在三種物質的不同官能團上，導致越走越偏離分離的軌跡，這里，三個物質共同含有的官能團可能也是影響分離的主要因素，換了個角度后，豁然開朗了。推翻了之前的方案，將離子對試劑換為四丁基氫氧化銨，從頭開始。

2.5 流動相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調pH=9.30）：乙腈=80：20。

混合對照圖譜：

流動相中添加三乙胺和并將pH調成9.3目的是抑制化合物1的拖尾，但是結果發(fā)現(xiàn)三種物質沒有分開。繼續(xù)優(yōu)化條件將pH值降低。

2.6 流動相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調pH=7.00）：乙腈=80：20。

混合對照圖譜：

看到這結果是不是項目就OK了。但是既然是方法開發(fā)，方法重現(xiàn)性實驗實驗是必不可少的，需要用一根新色譜柱重現(xiàn)該色譜條件。

結果問題就來了.....

化合物1圖譜：

化合物1峰型一直分叉，更終發(fā)現(xiàn)應該是色譜柱使用多種離子對試劑，造成色譜柱改性，新色譜柱不能重現(xiàn)結果。好吧，再開始。

然后又是繼續(xù)摸索。不得不說有時候運氣也是成功的一部分，在一次流動相配置過程中，看到四丁基氫氧化銨試劑旁邊還有一瓶四丁基溴化銨，突然我就冒出想法，用四丁基溴化銨試試，不知道結果會怎么樣，說做就做。

2.7 流動相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20。

混合對照圖譜：

03 結果

結果：分離度，峰型都滿足要求，完美。當然還是需要重現(xiàn)方法的。

三根新色譜柱重現(xiàn)結果：

更終色譜條件：

色譜柱：月旭Xtimate^? C18（4.6*250mm，5μm）。

流動相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20

檢測波長：220nm；

柱溫：30℃；

流速：1mL/min；

進樣體積：10μL。

搞定交差！

04 實驗小結

在液相應用方法開發(fā)過程中，首先需結合需要分離的目的，確定思路，一個方法更初的思路，是決定這個方法開發(fā)的效果，效率的更根本因素；其次是細節(jié)，任何細節(jié)都有可能導致你實驗的成功與否；更后是運氣，牛頓發(fā)現(xiàn)萬有引力還有運氣成分呢，說不定你是下一個。

同時，在一個方法確定好之后，一定需要使用一根新的色譜柱來驗證，因為在方法開發(fā)過程中，我們會使用到各種流動相條件，會對色譜柱一個改性，特別是使用離子對試劑的方法，否則后續(xù)的重現(xiàn)性問題會是一個非常頭痛的事情。